Cílem studie bylo zavést HPLC metodu pro stanovení albuminurie, potvrdit či vyvrátit tvrzení, že HPLC poskytuje falešně vyšší koncentrace albuminu v moči díky interferenci s dalšími bílkovinami, porovnat koncentrace albuminu v moči stanovené HPLC a imunoturbidimetricky. Materiál a metody: Metodu HPLC jsme zavedli za následujících podmínek: složení mobilní fáze: složka A) voda, složka B) acetonitril, složka C) 100 mM NaH2PO4 a složka D) 1 % trifluoroctová kyselina; kontinuální gradient mobilní fáze; průtok mobilní fáze 2 ml/min; teplota analýzy 22 ºC; UV detekce při 280 nm; kolona Zorbax 300 SB-C3, kapalinový chromatograf Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). Analyzovali jsme 2 směsné moči. Do směsi 1 připravené ze vzorků 30 imunoturbidimetricky negativních močí byl přidán standard albuminu. Směs 2 byla připravena z 30 imunoturbidimetricky „mikroalbuminurických“ vzorků. Soubor tvořilo 301 pacientů (161 diabetiků a 140 nediabetiků, 182 mužů a 119 žen, věk 44,1 ± 25,3 let). Výsledky: Za uvedených analytických podmínek transferin, α-1-kyselý glykoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin a hemopexin neinterferují s albuminem, zatímco eluční křivka prealbuminu se štěpí na několik píků, z nichž některé z nich s albuminem koeluují. Vzhledem k nízkým sérovým i močovým koncentracím prealbuminu lze usuzovat, že je tato interference klinicky nevýznamná. Ve směsi 1 jsme nezaznamenali významný rozdíl v hodnotách albuminurie mezi metodami (79,1 mg/l imunoturbidimetricky vs. 82,5 mg/l HPLC), oproti tomu, ve směsi 2 byla HPLC zjištěná hodnota o 26 % vyšší (79,5 mg/l imunoturbidimetricky vs. 99,9 mg/l HPLC). Tyto výsledky nasvědčují na existenci imunonereaktivního albuminu. Zjistili jsme statisticky významný rozdíl mezi metodami v případě pacientských vzorků moči (soubor všech pacientů [medián ± SEM]: 21,1 ± 38,2 mg/l imunoturbidimetricky vs. 30,4 ± 42,2 mg/l HPLC, p < 0,0001, Mann-Whitneyův test), nejmarkantnější u imunoturbidimetricky „normoalbuminurických“ diabetiků. Závěr: Naše výsledky svědčí pro vyšší senzitivitu HPLC metody pro zachycení „mikroalbuminurie“ (ve srovnání s imunoturbidimetrií). Uvedená HPLC metoda je dostatečně specifická pro stanovení albuminu v moči, nedochází k významným interferencím s dalšími bílkovinami., Objective: The aim of our study was the implementation of HPLC method for assessing albuminuria, confirming or refusing the hypothesis about the existence of co-eluting proteins, and comparison of urine albumin concentrations assessed using HPLC and immunoturbidimetric methods in patient samples. Material and Methods: We developed the HPLC method under these chromatographic conditions: multilinear gradient of mobile phase consisting of water (solvent A), acetonitrile (solvent B), 100 mM NaH2PO4 (solvent C), 1 % trifluoroacetic acid (solvent D), flow rate 2 mL/min, temperature 22 ˚C, UV detection in the wavelength 280 nm, chromatographic column Zorbax 300 SB-C3, liquid chromatograph Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). We analyzed two mixtures of urine. The first one was prepared from 30 patient urine samples with immunoturbidimetrically physiological albuminuria, to which we added albumin standard. The second mixture was prepared from 30 patient urine samples with mild albuminuria. We analyzed and compared albuminuria in a group of 301 patients (161 diabetics and 140 nondiabetics, 182 males and 119 females, age 44.1 ± 25.3 years). Results: Transferrin, α-1-acid glycoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin and hemopexin do not interfere with albumin in the presented HPLC method, whereas the elution curve of prealbumin splits into several peaks, of which a few interfere with albumin. With regard to very low prealbumin concentrations in serum and in urine, we can assume that this interference is not of clinical importance. In mixture 1 we did not find a significant difference between the albuminuria assessed using both methods (79.1 mg/L immunoturbidimetrically vs. 82.5 mg/L HPLC), while in mixture 2 we measured over 26 % greater albuminuria using HPLC (79.5 mg/L immunoturbidimetrically vs. 99.9 mg/L HPLC). These results suggest that immunounreactive albumin really exists. We found a statistically significant difference between the methods in patient urine samples (entire patients´ group: [median ± SEM]: 21.1 ± 38.2 mg/L immunoturbidimetrically vs. 30.4 ± 42.2 mg/L HPLC, p < 0.0001, Mann-Whitney test), which was most remarkable in the group of diabetic patients with immunoturbidimetrically physiological albuminuria. Conclusion: Our results prove that the HPLC method for albumin detection is more sensitive than immunoturbidimetry and sufficiently specific and there are no significant interferences with other proteins., and Fořtová M., Klapková E., Průša R.
Autor podává přehledné sdělení o stavu analýz biochemických markerů akutního koronárního syndromu ke konci roku 2008. Pojednává o úrovni standardizace, hodnotách rozhodovacích limitů (cut-off) a o stavu přesnosti výsledků měření. Hlavním vývojovým trendem je používání neustále senzitivnějších metod. To vede k významnému snižování hodnot mezí detekce a následně i hodnot cut-off. Přetrvávajícím nedostatkem je nesrovnatelnost výsledků a jejich enormní závislost na použité metodě. Hlavní příčinou je nedostatečná defi nice analytů a rozdílnost reagenčních protilátek použitých u různých metod. Z toho plyne i neefektivnost použití primárního referenčního materiálu NIST-SRM 2921. Důsledkem je různá klinická výpovědní hodnota při diagnóze a hodnocení prognózy stavu nemocných při použití různých metod stanovení., This minireview presents the recent state in measuring the biochemical markers for diagnosis and prognosis of acute coronary syndrome in 2008 year. The communication is based on the literature from 2008–2009. The described items include the level of standardization, cut-off values and precision of measurement particularly at cut-off values. Development of more sensitive methods with lower limit of detection and lower cut-off values is typical at present. Despite continued development strong non comparability of results reached by different methods remains. Poor defi nition of analytes and use of different reagent, Friedecký B., Kratochvíla J., and Lit.: 12
Úvod: Cerebrovaskulární rezerva (CVR) je jedním z důležitých parametrů k realizaci a monitoraci úspěšnosti angiochirurgické intervence u pacientů po ischemické cévní mozkové příhodě, tranzitorní ischemické atace nebo k upřesnění typu demence. Cíl: Cílem této práce je seznámit s provedením vazodilatačního testu s dipyridamolem jako možné alternativy farmakologické zátěže, s výskytem vedlejších účinků, získanými výsledky, jeho přednostmi a nedostatky. Soubor a metody: Byla provedena retrospektivní analýza 20 pacientů (8 žen, 12 mužů ve věkovém rozmezí 37–78 let) – 6 po TIA, 14 po ischemické cévní mozkové příhodě vyšetřených v průběhu dvou let. Snímání proběhlo na gamakameře Infinia Hawkeye s kolimátory fan beam technikou SPECT standardním způsobem za bazálních podmínek a v odstupu 1–13 dnů po farmakologické zátěži dipyridamolem (v 4minutové i.v. infuzi v dávce 0,84 mg/kg do 50 ml F1/1) s následnou i.v. aplikací 99mTc-HMPAO v 10. minutě. K potlačení vedlejší účinků zaznamenaných po dipyridamolu byl jako antidotum použit Syntophyllin i.v. Rozdíly bazální a pozátěžové studie byly hodnoceny vizuálně i semikvantitativně pomocí programu NeuroGamTMSegami a statistického parametrického mapování. Výsledky: 9 (45 %) pacientů mělo normální CVR, redukovaná se vyskytla u 11 pacientů (55 %). 8 pacientů (6 mužů, 2 ženy) s jednostrannou těsnou stenózou nebo okluzí vnitřní krkavice (ACI) bylo následně léčeno neurochirurgicky (karotická endarterektomie nebo arterio-arteriální extra-intrakraniální bypass). 6 (75 %) z těchto pacientů bylo s redukovanou CVR, 2 (25 %) měli normální CVR. Zbývajících 12 pacientů bylo léčeno konzervativně, 5 (42 %) z nich mělo redukovanou CVR (mírná redukce CVR nebo pacient rizikový k chirurgickému výkonu) a 7 (58 %) pacientů mělo normální CVR. Vedlejší účinky dipyridamolu (hypotenze, kašel, tlak na hrudi, bolest hlavy) byly zaznamenány u 5 pacientů, k ústupu potíží došlo během 2–5 minut. Závěr: Zátěžová perfuzní scintigrafie mozku s podáním dipyridamolu je vhodným testem k posouzení vaskulární rezervy mozku. Je to metoda neinvazivní, dobře dostupná a přispívá k rozhodnutí o neurochirurgickém zákroku., x, Renata Píchová, Helena Trojanová, Tomáš Peiskar, and Literatura
Úvod: Cílem práce je posoudit význam CEA, EGFR a hTERT jako markerů okultních nádorových buněk v břišní laváži v predikci léčebných výsledků u adenokarcinomu pankreatu, včetně stanovení jejich cut-off hodnot. Metoda: Práce porovnává skupinu 87 pacientů operovaných pro duktální adenokarcinom pankreatu ve stadiu III - IV (UICC) u nichž byl proveden paliativní výkon (biliodigestivní spojka, odběr biologického materiálu pro následnou onkologickou léčbu) s kontrolní skupinou 24 pacientů. U všech pacientů byly odebrány vzorky peritoneální laváže za použití 100 ml fyziologického roztoku (phosphate buffered saline, pH=7,2) do transportních lahví obsahujících 1,5 ml 0,5M EDTA a 10 ml fetálního bovinního séra. Celková RNA všech vzorků byla purifikována a zpracována procesem reverzní transkripce. Okultní nádorové buňky v peritoneální laváži byly detekovány RT-PCR metodou využitím CEA, EGFR a hTERT. Sekundárním cílem studie bylo stanovení cut-off hodnot exprese těchto markerů. Pro statistické analýzy byly použity softwary R (www.r-project.org) a Statistica (StatSoft, Inc., USA). Výsledky: Průměrná exprese CEA, EGFR a hTERT v peritoneální laváži kontrolní skupiny byla 2501, 716749, resp. 104 kopií mRNA/?g RNA. Prahové, cut-off hodnoty, byly stanoveny jako „průměr + 2x směrodatná odchylka“. Hodnoty absolutní exprese byly dále normalizovány na expresi house-keepingového genu glyceraldehdyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH). Cut-off hodnoty testovaných markerů po normalizaci byly 4,89; 115,88 resp. 0,02 kopií mRNA genu/kopií mRNA GAPDH. V případě absolutní exprese testovaných markerů, pouze hTERT dokáže statisticky významně (p <0,001) odlišit obě analyzované skupiny, kdy pacienti s pokročilým adenokarcinomem pankreatu mají vyšší hodnotu exprese hTERT. Absolutní exprese CEA ani EGFR nevykazovala statisticky signifikantní rozdíly mezi skupinou s pokročilým karcinomem pankreatu a kontrolní skupinou. Použitím přesnějších - normalizovaných hodnot exprese testovaných markerů byla prokázána statisticky významně vyšší exprese CEA a hTERT (p<0,005, resp. p<0,001) u pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu v porovnání s kontrolní skupinou. Závěr: Absolutní exprese hTERT v peritoneální laváži pacientů s pokročilým adenokarcinomem pankreatu byla signifikantně vyšší v porovnání s kontrolní skupinou. Naopak absolutní exprese CEA a EGFR nebyla signifikantně rozdílná., Introduction: The aim of this study is to assess the significance of CEA, EGFR and hTERT as markers of occult tumor cells for predicting treatment outcomes in pancreatic cancers, as well as determining the cut-off values of these markers individually in peritoneal lavage. Method: The study compared 87 patients undergoing palliative operations (bypass surgery, biological sampling for subsequent oncological treatment) for either stage III or IV (UICC) pancreatic ductal adenocarcinomas with a control group of 24 healthy patients. Abdominal cavity lavage was performed at the beginning of the surgery in both groups, using 100 ml of physiological solution (phosphate buffered saline, pH 7.2). The samples were transported in bottles containing 1.5 ml 0.5 M EDTA and 10 ml of fetal bovine serum. Total RNA samples were all processed and purified by reverse transcription. Occult tumor cells in the peritoneal lavage were detected by the real-time RT-PCR method using CEA, EGFR and hTERT as markers of tumor cells. Another aim was to calculate the cut-off values of these markers. Statistical analysis was done using software R (www.r-project.org) and Statistica (StatSoft, Inc. USA). Results: Mean expression of CEA, EGFR and hTERT in peritoneal lavage in the control group was 2501, 716749 and 104 copies of mRNA / mg RNA. Threshold, cut-off values were determined as the “mean + 2 times standard deviation”. Absolute expression values were further normalized to expression of the house-keeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). After normalization, cut-off values of the tested markers were 4.89, 115.88 and 0.02 copies of mRNA/GAPDH mRNA. As regards absolute expression of the markers tested, only hTERT was able to statistically significantly (p<0.001) distinguish the analysed groups, where patients with advanced pancreatic adenocarcinoma had a higher expression of hTERT. Absolute expression of CEA or EGFR was not able to discriminate between the two groups. The more accurate normalized expression values of the test markers demonstrated a statistically significantly higher expression of hTERT (p<0.005) and CEA (p<0.001) in patients with advanced adenocarcinoma compared to the control group. Conclusion: Absolute hTERT expression in peritoneal lavage of patients with advanced pancreatic cancer was significantly higher compared to the control group., and M. Ghothim, J. Srovnal, L. Bébarová, J. Tesaříková, P. Skalický, D. Klos, A. Prokopová, M. Vahalíková, H. Slavík, J. Vrbková, Č. Neoral, R. Havlík, M. Hajdúch, M. Loveček
Cíl studie: Zavedení nové techniky, kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií do rutinního stanovení hladiny celkového homocysteinu v plazmě. Materiál a metoda: Metodou kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií byly analyzovány vzorky pacientů zaslané do laboratoří Onkologického Centra J. G. Mendela. Výsledky: V pozitivním multiple reaction monitoring módu byl monitorován ion vzniklý rozpadem fragmentu m/z 135,9 → 89,8 pro homocystein a m/z 140 → 90 pro interní standard, homocystein-d4. Vyvinutá LC/MS/MS metoda má následující parametry: retenční čas homocysteinu i homocystinu-d8 1,4 minuty, mez stanovitelnosti 0,5 μmol/l, mez detekce 0,1 μmol/l. Opakovatelnost byla stanovena v sérii 20 měření analýzou 2 kontrolních vzorků, na hladině 8,3 μmol/l byl variační koeficient 0,12 %, na hladině 18,2 μmol/l byla hodnota variačního koeficientu 0,71 %. Závěr: Byla zavedena vysoce selektivní, specifická a časově nenáročná technika vhodná pro rutinní stanovení hladiny celkového homocysteinu v plazmě., Objective: To develop a new LC/MS/MS - based method for routine measurement of total homocysteine in plasma. Material and Method: Patient samples from laboratories of Cancer Centre of J. G. Mendel were analyzed by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Results: Ion transitions m/z 135.9 → 89.8 for homocysteine and m/z 140 → 90 for internal standard – homocysteine-d4 were monitored in the positive multiple reaction-monitoring mode. Our newly developed LC/MS/MS method has the following characteristics: retention time of homocysteine and homocystine-d8 is 1.4 min, limit of quantitation 0.5 μmol/l and limit of detection 0.1 μmol/l. Repeatability was determined by analyzing 2 plasma samples, the variation coefficients obtained were 0.12 % at concentration of 8.3 μmol/l and 0.71 % at concentration of 18.2 μmol/l. Conclusion: The selective, specific and rapid method suitable for routine determination of total homocysteine in plasma was developed., Soňa Humplíková, J. Minář, M. Kučerová, and Lit. 18
Fyzická aktivita hraje důležitou roli v léčbě metabolického syndromu, resp. diabetu 2. typu nebo obezity. Pouze necelých 20 % dospělé populace alespoň 2krát týdně provozuje fyzickou aktivitu. Z hlediska účinku fyzické aktivity je důležité sledovat tyto parametry: frekvence, intenzita a doba trvání. Nejobtížnější u obézních, resp. pacientů s metabolickým syndromem je stanovení optimální intenzity. Pro sledování intenzity fyzické aktivity se nejčastěji používá srdeční, resp. tepová frekvence. U pacientů, kteří užívají léky ovlivňující srdeční frekvenci, se užívá Borgova stupnice subjektivného vnímání fyzické zátěže. Pro optimální stanovení intenzity je nutné u těchto pacientů použít zátěžové testy. Pro nejpřesnější stanovení je vhodná kombinace spiroergometrie a CHR (clamped heart rate) testu. V praxi je ale dostatečné většinou kombinace současně ergometrie s Borgovou stupnicí. Sledování parametrů zátěže během cvičení zlepšuje komplianci pacientů a následně i výsledky cvičení., Martin Matoulek, and Lit. 5
Cíl: V rámci externí kontroly kvality SEKK, Gamapatie GP2/08 obdrželo 64 českých klinických laboratoří a 15 slovenských laboratoří vzorek moči od nemocné mnohočetným myelomem s Bence Jonesovou bílkovinou typu lambda. Metody: Laboratoře provedly typizaci paraproteinu v moči imunofi xací a stanovení celkové koncentrace bílkoviny v moči různými metodami, především turbidimetrií, metodou s pyrogallovou červení a s biuretovým činidlem. Výsledky: Získané výsledky byly významně rozdílné. Metodou vysokorozlišovací dvourozměrné elektroforézy s následným westernblottingem byly ve zkoumané moči prokázány především fragmenty lehkých řetězců lambda o molekulové hmotnosti 12 000 Da. Závěr: Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v moči je z různých důvodů poměrně obtížné. Tato skutečnost je ještě zvýrazněna při přítomnosti fragmentů Bence Jonesovy bílkoviny v moči, jak prokázala i tato práce., Background: The optimal method for the measurement of urinary monoclonal free light chain (FLC) concentration has not been established. We have carried out an external quality control assessment with the participation of 79 clinical biochemistry laboratories from the Czech Republic and Slovakia. Methods: The laboratories received a reference urine sample obtained from a patient with multiple myeloma and lambda FLC proteinuria and were asked to type the paraprotein using immunofi xation and to measure total urinary protein using their established method, most commonly turbidimetry, pyrogallol red assay, and biuret assay. Results: There was a very wide inter-laboratory variability in the protein concentration readouts with up to three-fold difference in some cases. High-resolution two-dimensional electrophoresis showed that a high proportion of the urinary paraprotein was composed of lambda light chain fragments with molecular weight of 12 kDa. Conclusions: Our results highlight the challenges of reliable and reproducible measurement of urinary protein concentration in the presence of urinary FLCs., M. Tichý, V. Maisnar, J. Stulík, J. Vávrová, B. Friedecký, V. Palička, J. Špirková, L. Žaloudková, L. Hernychová, J. Spáčilová, T. Buchler, R. Hájek, and Lit.: 14