Cílem studie bylo zavést HPLC metodu pro stanovení albuminurie, potvrdit či vyvrátit tvrzení, že HPLC poskytuje falešně vyšší koncentrace albuminu v moči díky interferenci s dalšími bílkovinami, porovnat koncentrace albuminu v moči stanovené HPLC a imunoturbidimetricky. Materiál a metody: Metodu HPLC jsme zavedli za následujících podmínek: složení mobilní fáze: složka A) voda, složka B) acetonitril, složka C) 100 mM NaH2PO4 a složka D) 1 % trifluoroctová kyselina; kontinuální gradient mobilní fáze; průtok mobilní fáze 2 ml/min; teplota analýzy 22 ºC; UV detekce při 280 nm; kolona Zorbax 300 SB-C3, kapalinový chromatograf Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). Analyzovali jsme 2 směsné moči. Do směsi 1 připravené ze vzorků 30 imunoturbidimetricky negativních močí byl přidán standard albuminu. Směs 2 byla připravena z 30 imunoturbidimetricky „mikroalbuminurických“ vzorků. Soubor tvořilo 301 pacientů (161 diabetiků a 140 nediabetiků, 182 mužů a 119 žen, věk 44,1 ± 25,3 let). Výsledky: Za uvedených analytických podmínek transferin, α-1-kyselý glykoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin a hemopexin neinterferují s albuminem, zatímco eluční křivka prealbuminu se štěpí na několik píků, z nichž některé z nich s albuminem koeluují. Vzhledem k nízkým sérovým i močovým koncentracím prealbuminu lze usuzovat, že je tato interference klinicky nevýznamná. Ve směsi 1 jsme nezaznamenali významný rozdíl v hodnotách albuminurie mezi metodami (79,1 mg/l imunoturbidimetricky vs. 82,5 mg/l HPLC), oproti tomu, ve směsi 2 byla HPLC zjištěná hodnota o 26 % vyšší (79,5 mg/l imunoturbidimetricky vs. 99,9 mg/l HPLC). Tyto výsledky nasvědčují na existenci imunonereaktivního albuminu. Zjistili jsme statisticky významný rozdíl mezi metodami v případě pacientských vzorků moči (soubor všech pacientů [medián ± SEM]: 21,1 ± 38,2 mg/l imunoturbidimetricky vs. 30,4 ± 42,2 mg/l HPLC, p < 0,0001, Mann-Whitneyův test), nejmarkantnější u imunoturbidimetricky „normoalbuminurických“ diabetiků. Závěr: Naše výsledky svědčí pro vyšší senzitivitu HPLC metody pro zachycení „mikroalbuminurie“ (ve srovnání s imunoturbidimetrií). Uvedená HPLC metoda je dostatečně specifická pro stanovení albuminu v moči, nedochází k významným interferencím s dalšími bílkovinami., Objective: The aim of our study was the implementation of HPLC method for assessing albuminuria, confirming or refusing the hypothesis about the existence of co-eluting proteins, and comparison of urine albumin concentrations assessed using HPLC and immunoturbidimetric methods in patient samples. Material and Methods: We developed the HPLC method under these chromatographic conditions: multilinear gradient of mobile phase consisting of water (solvent A), acetonitrile (solvent B), 100 mM NaH2PO4 (solvent C), 1 % trifluoroacetic acid (solvent D), flow rate 2 mL/min, temperature 22 ˚C, UV detection in the wavelength 280 nm, chromatographic column Zorbax 300 SB-C3, liquid chromatograph Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). We analyzed two mixtures of urine. The first one was prepared from 30 patient urine samples with immunoturbidimetrically physiological albuminuria, to which we added albumin standard. The second mixture was prepared from 30 patient urine samples with mild albuminuria. We analyzed and compared albuminuria in a group of 301 patients (161 diabetics and 140 nondiabetics, 182 males and 119 females, age 44.1 ± 25.3 years). Results: Transferrin, α-1-acid glycoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin and hemopexin do not interfere with albumin in the presented HPLC method, whereas the elution curve of prealbumin splits into several peaks, of which a few interfere with albumin. With regard to very low prealbumin concentrations in serum and in urine, we can assume that this interference is not of clinical importance. In mixture 1 we did not find a significant difference between the albuminuria assessed using both methods (79.1 mg/L immunoturbidimetrically vs. 82.5 mg/L HPLC), while in mixture 2 we measured over 26 % greater albuminuria using HPLC (79.5 mg/L immunoturbidimetrically vs. 99.9 mg/L HPLC). These results suggest that immunounreactive albumin really exists. We found a statistically significant difference between the methods in patient urine samples (entire patients´ group: [median ± SEM]: 21.1 ± 38.2 mg/L immunoturbidimetrically vs. 30.4 ± 42.2 mg/L HPLC, p < 0.0001, Mann-Whitney test), which was most remarkable in the group of diabetic patients with immunoturbidimetrically physiological albuminuria. Conclusion: Our results prove that the HPLC method for albumin detection is more sensitive than immunoturbidimetry and sufficiently specific and there are no significant interferences with other proteins., and Fořtová M., Klapková E., Průša R.
Je zde popsána metoda pro specifické stanovení kyseliny močové v lidském séru. Byla testována účinnost různých deproteinačních činidel. Výsledky získané proměřením 300 vzorků sér pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie byly porovnány s výsledky získanými rutinní enzymatickou metodou. Vzorky sér byly deproteinovány pomocí kyseliny chloristé a supernatanty byly analyzovány vysoce účinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi. Pro separaci byla užita kolona MAG 1, 4,6 x 150 mm, Biospher PSI 200, 5 µm. Mobilní fází byla směs 5% metanolu v 25 mmol/l dihydrogenfosforečnanu sodného (v/v), pH 4,75. Analytické parametry metody jsou vyhovující: variační koeficienty přesnosti v sérii a mezi sériemi se pohybovaly pod 5 %. Výtěžnost, určená metodou standardních přídavků, se pohybovala v rozmezí 90,0–103,4 %. Mez stavitelnosti byla 10,0 µmol/l (3,3 pmol/nástřik). Výsledky získané chromatografickou metodou dobře korelovaly s výsledky získanými rutinní enzymatickou metodou, avšak chromatografická metoda poskytovala vyšší hodnoty, a to v závislosti na dané skupině pacientů. Zde prezentovaná metoda je vhodná pro analýzu těch vzorků, u nichž klasická enzymatická metoda poskytuje nespolehlivé výsledky., A sensitive method for the specific determination of uric acid in human serum is described. The effectiveness of various protein precipitants was tested. Results from measurements by high-performance liquid chromatography on 300 serum samples were compared with an enzymatic method. Serum samples were deproteinized with perchloric acid and analyzed by reversed-phase high-performance liquid chromatography. For the separation, a reverse phase column MAG 1, 4.6 x 150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5 µm, was used. The mobile phase consisted of 5% methanol in 25- mmol/L sodium dihydrogenphosphate (v/v), pH 4.75. The analytical performance of this method is satisfactory: the intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 5%. Quantitative recoveries of spiked serum samples were between 90.0 – 103.4%. The limit of quantification was 10.0 µmol/L (3.3 pmol/inject). Results obtained by chromatographic method correlated well with an enzymatic method, but gave at average higher values depending on a group of patients. Presented method is useful for the analysis of samples where the classical enzymatic method do not give reliable results., Kanďár R., Žáková P., Mocová T., Skalický J. Kovařík J., and Lit.: 21
Úvod: Perfuzní scintigrafické vyšetření mozku slouží k spolehlivému ověření mozkové smrti pro účely transplantační medicíny či k volbě okamžiku možnosti ukončení reanimačních procedur. Smrt mozku je ireverzibilní vymizení všech mozkových funkcí včetně funkcí mozkového kmene bez ohledu na přetrvávající funkce kardiovaskulárního systému a jiné orgánové funkce. Stanovení mozkové smrti je zásadní diagnózou pro darování orgánů k transplantaci. Přípustnost odběru od zemřelého dárce a náležitosti zjištění smrti za účelem poskytování léčebné péče jsou v české legislativě pevně zakotveny. Metoda: Vyšetření provádíme na naší KNM od roku 2003 na dvouhlavých gamakamerách firmy Siemens. Radiofarmakum 99mTc-HMPAO aplikujeme intravenózně formou bolusu. Dynamická část je snímaná v přední projekci, statická část v přední, zadní a obou bočních projekcích. Výsledky: Od roku 2003 do června 2012 bylo provedeno 124 vyšetření u 118 pacientů (103 dospělých a 15 dětí) s klinickými známkami smrti mozku – potencionální dárci orgánů. U 8 pacientů nebyla mozková smrt potvrzena. Odběr orgánů nebyl proveden u 23 pacientů z důvodu různých kontraindikací nebo z důvodu nesouhlasu rodičů či zákonných zástupců u dětí. Závěr: Perfuzní scintigrafie mozku je metoda neinvazivní, technicky nenáročná, plně vyhovující a prakticky bez možnosti falešně pozitivního nálezu. Vyšetření nepřináší pro pacienta rizika komplikací, a proto je její zařazení do algoritmu vyšetření mozkové smrti naprosto vhodné., x, Drahoslava Nováková, Otakar Kraft, Radoslava Drozdková, and Literatura 15
Cíl studie: Vytvoření stratifikačního modelu s cílem identifikace vysoce rizikových osob s MGUS, u kterých bude možno zvažovat včasnou léčebnou intervenci. Typ studie: Retrospektivní studie Název a sídlo pracoviště: Interní hematoonkologická klinika, FN Brno - PMDV, Brno Materiál a metody: Na souboru 314 osob s MGUS zařazených do Registru monoklonálních gamapatií (RMG) byla provedena pilotní statistická analýza. Byla využita základní klinická data se zaměřením na prognostické parametry stávající (typ monoklonálního proteinu - MIG, hladina MIG, poměr sérových volných lehkých řetězců – FLC ratio) i nové (přítomnost cytogenetických aberací, flowcytometrické stanovení množství klonálních plazmocytů a přítomnost imunoparézy). Výsledky: Vyšší zastoupení morfologicky identifikovaných plazmocytů a nález >95 % PC aberantního fenotypu CD19- CD56+/- se statisticky významně častěji pojí s transformací MGUS do MM (p<0,05). Také přítomnost jakékoliv imunoparézy či imunoparézy postihující oba nepostižené imunoglobuliny byla statisticky významně častěji detekována u transformací MGUS do MM (p=0,001). První analýza stávajících a nových prognostických faktorů u MGUS dosáhla senzitivity stratifikace cca 50 % během 2 let. Závěr: Byl potvrzen význam hodnocení PC pomocí morfologie a průtokové cytometrie a důležitou úlohu hraje také přítomnost imunoparézy. Stratifikační modely budou dále vylepšovány s cílem dosažení senzitivity 90 % v rámci 2 let a obdobná analýza bude provedena také u asymptomatických myelomů (aMM)., Objective: The creation of the stratification model and identification of high-risk individuals with MGUS, which should be considered to an early therapeutic intervention. Design: The retrospective study Settings: Department of Internal medicine - Hematooncology, University Hospital Brno Material and Methods: The pilot statistical analysis of 314 MGUS subjects from Registry of Monoclonal Gammopathies (RMG) was done. Basic clinical data were used together with existing (type of monoclonal protein - MIG, level of MIG, serum free light chain ratio – FLC ratio) and new prognostic parameters (presence of cytogenetic abnormalities, flow cytometry enumeration of clonal plasma cells and presence of immunoparesis). Results: Higher number of plasma cells according to the morphology and presence of >95 % PC with aberrant phenotype CD19-CD56+/- as well were more frequently associated with transformation of MGUS into MM (p<0.05). Also, the presence of any immunoparesis and/or immunoparesis affecting both uninvolved immunoglobulins was more frequently detected in transformed MGUS (p=0.001). The first analysis of existing and new prognostic factors in MGUS achieved sensitivity of the stratification about 50 % within 2 years. Conclusion: The significance of morphological and flow cytometry assessment of PCs was confirmed and presence of the immunoparesis plays an important role as well. Model of stratification will be further developed with the aim of achieving 90 % sensitivity within 2 years and a similar analysis will be performed also for asymptomatic multiple myeloma (aMM)., Heřmanová Z., Pika T., Lochman P., Ščudla V., and Literatura 22
Cíl studie: Sledování sérových hladin markerů karcinomu prostaty PSA, %freePSA, [-2]proPSA a výpočet PHI v časné dia - gnostice karcinomu prostaty. Typ studie: Pilotní studie Materiál a metody: V imunoanalytické laboratoři Fakultní nemocnice Plzeň (FN) byla vyšetřena séra 76 pacientů Urologické kliniky FN s podezřením na karcinom prostaty a indikovaných k biopsii prostaty pod ultrasonografickou kontrolou (TRUS). U všech pacientů byla stanovena hladina celkového PSA, a pokud byla mezi 0 – 30 μg/l, bylo doplněno stanovení hladin freePSA, [-2]proPSA, vypočítán poměr %freePSA a Prostate Health Index (PHI). Stanovení sledovaných biomarkerů se prováděla chemiluminiscenční metodou na přístroji DxI 800 (Beckman Coulter, USA). Pro veškeré statistické výpočty byl použit statistický software SAS verze 9.2. Výsledky: Nalezli jsme statisticky signifikantně zvýšené hladiny [-2]proPSA a PHI u pacientů s histologicky potvrzeným karcinomem prostaty oproti pacientům s benigní hyperplazií prostaty ([-2]proPSA medián 14 vs. 27 ng/l, PHI medián 35 vs. 77). Naopak u celkového PSA a %freePSA jsme statisticky významné rozdíly v hladinách nenalezli (mediány tPSA 7,1 vs. 7,7 μg/l a %freePSA 16 vs. 11,4 %). Závěr: Pro zpřesnění diferenciální diagnostiky benigní hyperplazie se zdá být stanovení [-2]proPSA a vypočtení indexu PHI velkým přínosem., Objective: Monitoring changes in the levels of biomarkers PSA, %fPSA, [-2]proPSA and calculation of PHI in the diagnostic algorithm of early prostate cancer. Design: Pilot study Material and Methods: The Immunoanalytical Laboratory of University Hospital in Pilsen examined sera of 76 patients from the Urology department of the University Hospital with suspected prostate cancer who have undergone TRUS biopsy. We assessed the levels of PSA and, if the interval of PSA was between 0-30 μg/l, we also assessed the levels of freePSA, [-2]proPSA and we calculated %fPSA and Prostate Health Index (PHI). The monitored biomarkers were measured using the chemiluminescent DxI 800 instrument (Beckman Coulter, USA). All statistical analyses were calculated using the SAS version 9.2 software. Results: We found statistically significant increased levels of [-2]proPSA and PHI in patients diagnosed with prostate cancer by prostate biopsy vs. patients with benign prostate hypertrophy ([-2]proPSA median 14 vs. 27 ng/l, PHI median 35 vs. 77). On the contrary, we did not find any significant difference in tPSA and %freePSA (median tPSA 7.1 vs. 7.7 μg/l and %freePSA 16 vs.11.4%). Conclusion: The assessment of [-2]proPSA and the calculation of PHI appear to be of great benefit for a more accurate differential diagnosis of benign hyperplasia., Fuchsová R., Topolčan O., Klečka J., Vrzalová J., Hora M., Kučera R., Dolejšová O., Hes O., and Literatura
Cíl studie: Tau protein je neurocytoskeletální bílkovina, jejíž koncentrace se zvyšují v mozkomíšním moku (MMM) při poškození axonů a neuronální degeneraci. Cílem práce bylo vyšetřit tau protein v MMM pacientů s roztroušenou sklerózou (RS) a dalších neurologických pacientů a současně porovnat dvě soupravy ELISA na stanovení celkového tau proteinu. Typ studie: Průřezová. Název a sídlo pracoviště: Univerzita Karlova v Praze, 1. LF a VFN, Ústav lékařské biochemie, Praha; Univerzita Karlova v Praze, 3. LF a FNKV, Neurologická klinika, Praha; Univerzita Karlova, 1. LF a VFN, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky, Praha. Materiál a metody: Koncentrace celkového tau proteinu v MMM byla porovnávána mezi 20 pacienty s RS a 18 pacienty s různými neurologickými onemocněními, u nichž se nepředpokládala přítomnost neuronální degenerace. Celkový tau protein byl měřen dvěma soupravami ELISA INNOTEST™ hTAU Ag (INNOGENETICS N.V. Belgie) a Human Tau (total) (Invitrogen, USA). Výsledky: Základní analytické vlastnosti obou souprav ELISA jsou srovnatelné. Koncentrace celkového tau proteinu získané soupravou INNOTEST™ hTAU Ag dosahovaly významně vyšších hodnot ve srovnání se soupravou Human Tau (total) (p < 0,0001). Byla však prokázána dobrá shoda pomocí Blandova-Altmanova grafu a Passingovy-Bablokovy regrese. Koncentrace celkového tau proteinu v mozkomíšním moku se statisticky významně nelišily mezi RS [medián (25.–75. percentil; Human Tau (total): 75 (58–133) ng/l; INNOTEST™: 127 (90–221) ng/l] a kontrolními neurologickými pacienty [Human Tau (total) 62 (46–94) ng/l; INNOTEST™:119 (69–185) ng/l]. Závěr: Při hodnocení absolutních koncentrací celkového tau proteinu v MMM je nutné přihlížet k použité soupravě. Vzhledem ke shodě mezi výsledky je možné přepočítat koncentrace mezi soupravami pomocí rovnice Passingovy-Bablokovy regrese. Zdá se, že tau protein spíše není vhodným ukazatelem neuronálního postižení u RS., Objective: Tau protein belongs to the neuro-cytoskeletal proteins. Its concentration increases in the cerebrospinal fluid (CSF) due to the axonal damage. The aim of the study was to examine the CSF levels of total tau protein in the patients with multiple sclerosis (MS) and others neurological diseases and to compare two ELISA kits for the tau determination. Design: cross-sectional. Material and methods: We compared tau protein concentrations in CSF between 20 MS patients and 18 patients with other neurological diseases without signs of neuronal degeneration. Total tau protein was measured by two ELISA kits – INNOTEST ™ hTAU Ag (INNOGENETICS N.V. Belgie) and Human Tau (total) (Invitrogen, USA). Results: The basic analytical characteristics of both ELISA kits were similar. A good agreement between two ELISA kits was obtained by Bland-Altman plot as well as by Passing-Bablok regression. However, the results obtained by INNOTEST™ hTAU Ag were significantly higher in comparison with those obtained by Human Tau (total) ELISA (p < 0.0001). The CSF tau levels in the MS patients did not differ from those in the control group [median (25th–75th) percentile; MS group: Human Tau (total) 75 (58–133) ng/l; INNOTEST™ 127 (90–221) ng/l; controls: Human Tau (total) 62 (46–94) ng/l; INNOTEST™ 119 (69–185) ng/l]. Conclusion: It is necessary to take in consideration the used ELISA kits in the evaluation of the results of the total tau examination. A conversion of the concentrations measured by one kit can be calculated to those by the other kit using a Passing-Bablok regression equation. It seems that CSF tau concentration is not an appropriate biomarker of neuronal degeneration in MS patients., Fialová L., Bartoš A., Švarcová J., Doležil D., Malbohan I., and Lit.: 28