Cíl studie: Výsledek každé analýzy DNA je do značné míry závislý na typu biologického materiálu použitého pro extrakci nukleových kyselin. Cílem naší studie je porovnat vlastnosti DNA extraktů získaných dvěma různými izolačními postupy z buněk bukální sliznice, močového sedimentu, nehtů, vlasových kořínků a periferních krevních buněk. Materiál a metody: Biologické vzorky byly získány od 24 dobrovolníků s mediánem věku 31 let (25–54 let). Izolace DNA byla provedena fenol-chloroformovou extrakcí a pomocí separačních mikrokolonek (Qiagen). Eluční objem byl v obou případech 50 μl. Extrakty byly charakterizovány spektrofotometricky, fluorimetricky, elektroforeticky a z hlediska účinnosti následné PCR amplifikace. Výsledky: Nejvyšší koncentrace DNA obsahovaly extrakty z buněk periferní krve a bukální sliznice; nejnižší koncentrace DNA byly izolovány z vlasových kořínků. Všechny typy extraktů měly uspokojivou čistotu (mediány v rozmezí 1,7–1,9). Podíl nefragmentované DNA ve vzorcích získaných mikrokolonkovou metodou byl téměř dvojnásobný v porovnání s fenolovou extrakcí. Procentuální zastoupení nefragmentovaných molekul klesal podle biologického zdroje v následující řadě: krev (73,3 %) > bukální sliznice (63,5 %) > močový sediment (31,3 %) > nehty (25,3 %) > vlasy (20,4 %). Amplifikační účinnost u extraktů z periferní krve, bukálního stěru a močového sedimentu byla vyšší než u extraktů z nehtů a vlasů. Závěr: Všechny analyzované extrakty pocházející z krevních buněk, bukální sliznice, močového sedimentu, nehtů a vlasů poskytly dostatek DNA molekul k provedení molekulárně biologických vyšetření. Nejvhodnějšími materiály byly krevní buňky a buňky bukální sliznice. Z nich připravené extrakty měly nejvyšší koncentraci a čistotu DNA bez ohledu na použitou izolační metodu, nejnižší podíl degradované DNA a nejvyšší účinnost amplifikace krátkých i dlouhých amplikonů., Objective: Results of DNA testing depend in many cases on the type of biological material used for extraction of nucleic acids. The aim of the study is to compare properties of DNA extracts prepared using two different isolation procedures from buccal cells, urine sediment, nails, hair roots, and peripheral blood cells. Material and Methods: Biological material was collected from 24 volunteers at median age of 31 years (range 25–54 years). Phenol–chloroform extraction and spin microcolumn extraction method (Qiagen) were used for DNA isolation. In both the procedures, the elution volume was 50 μl. The extracts were characterized optically (UV spectrophotometric and fluorimetric analyses), electrophoretically, and by PCR amplification efficiency. Results: The highest DNA concentrations were found in extracts from peripheral blood and buccal cells; the lowest DNA concentrations were in hair extracts. All types of the extracts had acceptable purity (medians 1.7–1.9). The content of nonfragmented DNA molecules in the microcolumns extracts was almost twofold higher in comparison to the phenol ones. The percentages of non-fragmented DNA decreased as follows: blood (73.3 %) > buccal cells (63.5 %) > urine sediment (31.3 %) > nails (25.3 %) > hair roots (20.4 %). The amplification efficiency in the peripheral blood, buccal swab, and urine extracts was significantly higher than in the nail and hair extracts. Conclusion: All analyzed DNA extracts received from blood, buccal cells, urine sediment, nails, and hair roots provided a sufficient number of integral DNA molecules for following DNA testing. The best quality of DNA was found in extracts from blood and buccal cells (high concentrations and purity, low degree of fragmentation, and high efficiency of amplification for either short or long PCR amplicons)., Beránek M., Hegerová J., Drastíková M., and Literatura 25
Clinical oncologists have been focusing their efforts on attempting to define risk groups of patients with unusual biological reactions to the recommended therapy regimens using molecular biology techniques. The aims of our study were: (i) to find a design and validate a method for fast and reliable analysis of the D1853N (5557G>A) genetic polymorphism in the ATM (ataxia-telangiectasia mutated) gene; (ii) to use side-directed mutagenesis to generate ATM 5557A-positive DNA (reference ATM5557A DNA); and (iii) to analyze a group of patients suffering from cervical carcinoma with adverse responses to radiotherapy. The 5557A variant was found in three of twenty women (15%). Our data show that the prevalence of the 5557A allelic variant in cervical cancer subjects with adverse responses after irradiation probably does not differ from the prevalence common in Caucasians. A larger population study should confirm these preliminary results., Martin Beránek, Monika Drastíková, Simona Paulíková, Igor Sirák, Milan Vošmik, Jiří Petera, and Literatura 31
Cíl studie: Plynová chromatografie se v diagnostice užívá pro speciální stanovení, například profilu organických kyselin v moči nebo séru. Tato metoda ovšem umožňuje, zejména pak ve svém dvojdimenzionálním uspořádání (GC×GC), mnohem ucelenější pohled na vybraný biologický materiál. Cílem práce bylo vyvinout postup pro komplexní analýzu biologického materiálu. Typ studie: Vývoj analytické metody Název a sídlo pracoviště: Laboratoř dědičných metabolických poruch, Fakultní nemocnice, Olomouc Materiál a metody: Analýzy byly provedeny na GC×GC (Agilent 7890) spojeném s průletovým hmotnostním analyzátorem (TOF MS) (LECO Pegasus 4D). Automatické zpracování dat bylo provedeno programem ChromaTOF (LECO) za použití „reference.“ Výsledky: V této studii byla vytvořena tzv. reference metabolitů, obsahující zejména organické kyseliny, aminokyseliny a látky podobné povahy, které byly derivatizovány dvěma postupy – silylací nebo alkylací methylchloroformiátem. Aplikací reference na naměřené vzorky bylo možno identifikovat (shoda 733–999) více než 100 analytů v každém vzorku. Závěry: GC×GC-TOF je vhodná metoda pro metabolomickou analýzu mnoha biologických matricí a může být také uplatněna v diagnostice metabolických onemocnění. Zpracování dat lze plně automatizovat., Objective: Gas chromatography is used in diagnostics mostly for special analyses e.g. organic acids profiling in urine or serum. But this method enables, especially in two-dimensional version (GC×GC), more comprehensive view on selected biological material. The aim of this work was to develop a method for complex analysis of biological material. Design: Analytical method development Settings: Laboratory for Inherited Metabolic Disorders, Palacky University and University Hospital, Olomouc Material and methods: Analyses were performed on GC×GC (Agilent 7890) coupled with time-of-flight mass analyzer (TOF MS) (LECO Pegasus 4D). An automated data processing was performed by the ChromaTOF software (LECO) using “reference” tool. Results: In this study, the list of metabolites was created. It covers predominantly organic acids, amino acids, sugars, and similar – silylated or alkylated via methylchloroformiate. After applying the reference we were able to identify (spectral matches of 733–999) more than 100 analytes in each sample. Conclusion: GC×GC-TOF is a valuable tool in metabolomic analysis of many biological matrices and enables also diagnosing metabolic disorders. Data processing can be fully automated., Wojtowicz P., Dostálová E., Adam T., and Literatura 2
Cíl studie: Vytvoření stratifikačního modelu s cílem identifikace vysoce rizikových osob s MGUS, u kterých bude možno zvažovat včasnou léčebnou intervenci. Typ studie: Retrospektivní studie Název a sídlo pracoviště: Interní hematoonkologická klinika, FN Brno - PMDV, Brno Materiál a metody: Na souboru 314 osob s MGUS zařazených do Registru monoklonálních gamapatií (RMG) byla provedena pilotní statistická analýza. Byla využita základní klinická data se zaměřením na prognostické parametry stávající (typ monoklonálního proteinu - MIG, hladina MIG, poměr sérových volných lehkých řetězců – FLC ratio) i nové (přítomnost cytogenetických aberací, flowcytometrické stanovení množství klonálních plazmocytů a přítomnost imunoparézy). Výsledky: Vyšší zastoupení morfologicky identifikovaných plazmocytů a nález >95 % PC aberantního fenotypu CD19- CD56+/- se statisticky významně častěji pojí s transformací MGUS do MM (p<0,05). Také přítomnost jakékoliv imunoparézy či imunoparézy postihující oba nepostižené imunoglobuliny byla statisticky významně častěji detekována u transformací MGUS do MM (p=0,001). První analýza stávajících a nových prognostických faktorů u MGUS dosáhla senzitivity stratifikace cca 50 % během 2 let. Závěr: Byl potvrzen význam hodnocení PC pomocí morfologie a průtokové cytometrie a důležitou úlohu hraje také přítomnost imunoparézy. Stratifikační modely budou dále vylepšovány s cílem dosažení senzitivity 90 % v rámci 2 let a obdobná analýza bude provedena také u asymptomatických myelomů (aMM)., Objective: The creation of the stratification model and identification of high-risk individuals with MGUS, which should be considered to an early therapeutic intervention. Design: The retrospective study Settings: Department of Internal medicine - Hematooncology, University Hospital Brno Material and Methods: The pilot statistical analysis of 314 MGUS subjects from Registry of Monoclonal Gammopathies (RMG) was done. Basic clinical data were used together with existing (type of monoclonal protein - MIG, level of MIG, serum free light chain ratio – FLC ratio) and new prognostic parameters (presence of cytogenetic abnormalities, flow cytometry enumeration of clonal plasma cells and presence of immunoparesis). Results: Higher number of plasma cells according to the morphology and presence of >95 % PC with aberrant phenotype CD19-CD56+/- as well were more frequently associated with transformation of MGUS into MM (p<0.05). Also, the presence of any immunoparesis and/or immunoparesis affecting both uninvolved immunoglobulins was more frequently detected in transformed MGUS (p=0.001). The first analysis of existing and new prognostic factors in MGUS achieved sensitivity of the stratification about 50 % within 2 years. Conclusion: The significance of morphological and flow cytometry assessment of PCs was confirmed and presence of the immunoparesis plays an important role as well. Model of stratification will be further developed with the aim of achieving 90 % sensitivity within 2 years and a similar analysis will be performed also for asymptomatic multiple myeloma (aMM)., Říhová L., Sandecká V., Klincová M., Varmužová T., Suská R., Zarbochová P., Mikulášová A., Smetana J., Grešliková H., Kupská R., Němec P., Bartoňová J., Kuglík P., Penka M., Hájek R., and Literatura 24
Klasifikácia SZO (2008) je jediná celosvetovo akceptovaná a v praxi používaná klasifikácia nádorových ochorení kostnej drene (KD), ktorá definuje aj postavenie a význam biopsie KD v diagnostickom algoritme. Myeloproliferatívne neoplázie (MPN) tvoria pestrú skupinu ochorení s variabilne dynamickým rozvojom z počiatočných štádií, cez štádiá s plno rozvinutou klinicko-laboratórnou manifestáciou až do pokročilých štádií – fibrotickej, resp. blastovej transformácie, sprevádzaných zmenami morfológie a laboratórneho obrazu. V počiatočných štádiách je určenie typu MPN len na základe klinicko-laboratórnych údajov pre podobnosť ich klinickej manifestácie nespoľahlivé. Dôkaz pre MPN typických genetických mutácií potvrdzuje klonalitu ochorenia, ale jeho typizačný význam je limitovaný. Naopak, bioptické vyšetrenie KD v kontexte dostatočných klinických informácií, výsledkov laboratórnych vyšetrení a s podporou genetických vyšetrení umožňuje okrem potvrdenia MPN aj bližšiu typizáciu, ktorá je prognosticky relevantná a ovplyvňuje aj voľbu terapie. Zároveň umožňuje odlíšenie reaktívnych zmien hemopoézy, zhodnotenie prognosticky významných morfologických znakov (stupeň myelofibrózy, množstvo blastov) a sledovanie progresie ochorenia do fibrotickej, resp. blastovej transformácie. V týchto pokročilých štádiách a po terapii nie je však typizácia MPN len na základe morfológie KD možná. Výpovedná hodnota biopsie závisí od kvality a kvantity vzorky drene, hodnotenie morfológie KD závisí aj od vedomostí a skúseností vyšetrujúceho patológa., WHO classification (2008) is the only world-wide accepted and in routine praxis used classification of bone marrow (BM) neoplasms defining also the importance of BM biopsy within the diagnostic algorithm. Myeloproliferative neoplasias (MPN) represent a heterogenous group of disorders with variable dynamic transformational potential from initial into advanced stages such as blast crisis or myelofibrotic transformation. Because of similar manifestations, the typing of MPN in their initial stages based on clinical and laboratory parameters is not optimal. The finding of MPN-typical genetic mutations proves the disease clonality, but not a diagnosis of individual MPN types. In contrast, the BM biopsy verifies both the diagnosis and MPN type. It helps also to discriminate MPN from reactive hematopoietic changes, to evaluate prognostically relevant BM features (e.g. grade of myelofibrosis, blasts number) and the follow-up to terminal stages. However, the MPN typing in terminal and posttherapeutical stages based on morphology alone is not sufficient. The diagnostic value of BM biopsy depends on specimen´s quality, the objectivity of BM morphology evaluation depends on pathologist´s training and experiences. A correct BM biopsy interpretation should be done within the context of sufficient clinical and laboratory data and with support of genetical analyses. myelofibrosis, bone marrow biopsy., Juraj Marcinek, Tatiana Burjanivová, Lukáš Plank, and Literatura 28
Bronchial asthma and obesity is among a group of multietiologic complex diseases which influence each other in their origin, and development. The impact on the patient‘s quality of life and prognosis is significant, health costs included. Because of the increasing prevalence worldwide, there has been an increase in the amount of studies dealing with reciprocal associations between asthma and obesity., Jana Kryštofová, Miloš Jeseňák, Peter Bánovčin, and Literatura 39
Nejzhoubnější gynekologický nádor, karcinom ovaria, je příčinou více než 50 % úmrtí v této skupině nádorů. Více než 60 % případů je diagnostikováno až v pokročilých stadiích s výrazně sníženou pravděpodobností přežití pacientek. Diagnostické nástroje pro efektivní časnou detekci nebo screening zatím neexistují. Terapeutické možnosti (chirurgická operace, chemoterapie) jsou nedostatečně efektivní, neboť karcinom ovaria se vyznačuje silnou tendencí k recidivě spojenou s chemorezistencí. Jedním z nejdéle a nejrozsáhleji používaným markerem pro diagnostiku primárních nádorů i recidivy je CA125/MUC16. Tento glykoprotein je znám již od 80. let 20. století, ale teprve nejnovější studie odhalují jeho biologické funkce v karcinogenezi a interakcích s buňkami imunitního systému. V tomto článku se blíže podíváme na jeho biologický význam a především na současný stav použití CA125 jako významného diagnostického markeru u karcinomu ovaria. V diagnostice primárních nádorů se totiž začínají objevovat nové markery, navíc je význam monitoringu CA125 z hlediska detekce recidivy zpochybňován rozsáhlými klinickými studiemi, které nenalezly přínos pro dlouhodobé přežití pacientek. Také potenciální význam CA125 v imunoterapii karcinomu ovaria se nezdá být tak velký, jak se předpokládalo., The most fatal gynecologic malignancy, ovarian cancer, causes more than 50% deaths in this tumor group. Most of cases (>60%) are diagnosed in advanced stages with poor 5-year survival prognosis. Diagnostic tools for an effective early detection or screening have not been found yet. Treatment possibilities (surgery, chemotherapy) are insufficient while high tendency to recurrence and chemoresistance occurs. CA125/MUC16 has been one of the most extensively used markers for a detection of primary tumors, or recurrence for a long time since its discovery in 80´s. However, the structure and biological functions of CA125 have been discovered relatively recently. CA125 may play an important role in carcinogenesis and interactions with cells of immune system. We reviewed the known biological functions and particularly the current state of using this marker as the diagnostic tool in ovarian cancer. Recently, many new markers emerged ambitiously to replace CA125; moreover, the importance of monitoring CA125 for the recurrence detection has also been questioned in large clinical trials. These studies have not found an impact for overall survival/mortality of patients. Also a potential of using CA125 targeted antibodies has not brought previously expected results so far., Luděk Záveský, and Literatura 20
Cíl. Posoudit stupeň korelace výsledků chemické analýzy urolitiázy pomocí výpočetní tomografie s duální energií záření (DECT) s laboratorní chemickou analýzou konkrementů a zhodnotit přínos metody DECT pro klinickou praxi. Metoda. Celkem 67 pacientů bylo vyšetřeno pomocí DECT s požadavkem na chemickou analýzu již známé či suspektní urolitiázy. K analýze chemického složení konkrementů pomocí DECT jsme využili simultánní expozici 140 kV a 80 kV. Získaná data byla analyzována pomocí programu Syngo Dual Energy Siemens v modulu Kidney Stones. U 30 pacientů byl následně proveden urologický výkon s extrakcí litiázy a jejím chemickým rozborem. V tomto souboru jsme pak korelovali výslednou chemickou skladbu urolitiázy získanou oběma metodami. Výsledky. V souboru 30 pacientů se podařilo prokázat u konkrementů velikosti nad 3 mm 100% senzitivitu a 100% specificitu DECT analýzy. V případě velmi drobné urolitiázy (tj. pod 3 mm) je přesnost detekce 100%, ale schopnost diferenciace na jednotlivé typy urolitiázy snížená na 97 %. Závěr. Metoda DECT analýzy urolitiázy vykazuje u konkrementů nad velikost 3 mm 100% shodu výsledků v porovnání s chemickou laboratorní analýzou močových konkrementů a má tedy velký přínos pro klinickou praxi, zejména v možnosti včasného zahájení vhodného terapeutického postupu., Aim. To assess the degree of correlation between the results of chemical analysis of urolithiasis using dual energy computed tomography (DECT) with laboratory chemical analysis of stone, and to evaluate the contribution of this method to clinical practice. Method. Total 67 patients underwent DECT in order to performe the chemical analysis of already known or suspected urolithiasis. To analyze the chemical composition of the stone using DECT, we used the simultaneous exposure to 140 kV and 80 kV. The obtained data were analyzed using software Syngo Siemens Dual Energy in program "Kidney Stones". The method of the analysis was based on a material decomposition algorithm. In 30 patients, the extraction ofthe stone followed and the chemical and crystalograpic analysis was made. The results of virtual chemical analysis and laboratory findings were compared. Results. In the stones greater than 3 mm, sensitivity and specificity reached 100% using DECT analysis. In the case of very small stone disease (ie. less than 3 mm), the detection reached 100% accuracy, but the ability to differentiate the correct type of stone disease decreased to 97 %. Conclusion. DECT analysis of urolithiasis shows the stones of size 3 mm with 100% match results in comparison with laboratory chemical analysis of urinary stones and therefore has great benefit for clinical practice, especially early in choosing the appropriate therapeutic procedure., Bednářová A, Ferda J, Kreuzberg B, Klečka J, Hora M., and Literatura 6
V České republice je kolorektální karcinom jedním z nejčastějších zhoubných nádorů a až 40 % pacientů je diagnostikováno v pokročilém stadiu. Chirurgická léčba je základní léčebnou modalitou vedoucí k vyléčení, a to i v případě pokročilého onemocnění. Zavedení nových cytostatik do praxe výrazným způsobem rozšířilo léčebné možnosti i u pacientů, kteří nejsou primárně chirurgicky léčitelní. V kombinaci s biologickou léčbou pak lze dosáhnout operability i u donedávna inoperabilních stavů, a tím tak významně prodloužit život pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. U pacientů s metastatickým postižením jater jak primárně operabilním, tak inoperabilním je ve většině případů indikována neoadjuvantní chemoterapie/chemobioterapie. I když dosud nebyl definován nejvhodnější režim, základním požadavkem na něj je jeho nízká toxicita a vysoká účinnost., Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors in the Czech Republic, and up to 40 % of patients are diagnosed at an advanced stage. Surgical treatment is the primary modality of therapy leading to cure colorectal cancer even in advanced disease. The introduction of new chemotherapeutic agents in practice greatly increased treatment options in patients who are not surgically curable. In combination with biological therapy, it can be achieved operability even in recently unresectable stage and thereby significantly prolonged life of patients with metastatic colorectal carcinoma. In patients with metastatic liver disease, both resectable or unresectable, is usually used neoadjuvant chemotherapy/chemobiotherapy. Although there is not defined the best treatment regimen yet, a basic requirement is low toxicity and high efficiency., Jana Halámková, Jiří Tomášek, Šárka Bohatá, Igor Kiss, and Lit.: 6