An innovative method for the preparation of fully hydrated samples of microbial biofilm Candida parapsilosis is presented in this study. Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) and high-pressure freezing (HPF) rank among cutting edge techniques in the electron microscopy of hydrated samples such as biofilms. However, the combination of these techniques is not always easily applicable. Therefore, we present a method of combining high-pressure freezing using EM PACT2 (Leica Microsystems), which fixes hydrated samples on small sapphire discs with a diameter 1.4 mm, with a high resolution SEM (Jeol) equipped with the widely used cryo-preparation system ALTO 2500 (Gatan). Using a holder developed in house, a freeze-fracturing technique was applied to image yest cultures cultivated on the sapphire discs. The main goal of our investigations was the detailed visualization of biofilm extracellular matrix and areas where the microbial cells adhere to the substrate/surface. and Předložená studie představuje nové technické řešení umožňující kombinaci mrazového lámání (freeze- -fracturing) malých safírových disků s poloměrem 1,4 mm používaných pro vysokotlaké mražení (high pressure freezing, HPF) a zobrazování pomocí kryogenní rastrovací elektronové mikroskopie (cryo-SEM). Práce zahrnuje podrobný popis metodologie a její demonstraci na plně hydratovaných vzorcích kvasinkových biofilmů, kmen Candida parapsilosis, který patří mezi významné mikroorganismy v klinické praxi. Cryo-SEM a HPF jsou považovány za špičkové techniky v elektronové mikroskopii, avšak jejich kombinace není vždy snadno použitelná. Popsané technicko-metodologické řešení umožňuje kombinaci vysokotlakého zmrazování pomocí EM PACT2 (Leica Microsystems) a zobrazování perpendikulárního mrazového lomu pomocí SEM (Jeol), který je vybaven systémem ALTO 2500 (Gatan). Pro uchycení vzorku a jeho následné lámání byl vyvinut speciální držák, jehož použití je demonstrováno na několika experimentech zabývajících se výzkumem ultrastruktury mikrobiálních biofilmů, kde je hlavním cílem vizualizace biofilmu se zaměřením na kvalitu promražení jeho extracelulární polymerní substance (EPS) a detekce oblasti přilnutí mikrobiálních buněk k substrátu/povrchu safírového disku.