Cathodoluminescence is a phenomenon of some materials which is generated by electron beam interaction with a luminescence matter. The result of this interaction is production of the photons of infrared, visible and ultraviolet parts of electromagnetic spectrum. The technique to release the photons from luminescence materials can be applied to semiconductors, grains of minerals, chemical substances providing fluorescence; or specific labels bound to biological samples. The method serves for their deeper ultrastructural analysis. This presented study is focused on cryo-system which is a part of scanning electron microscope and its utilization in measurement of cathodoluminescence, especially the dependence of its spectrum on temperature of samples. and Katodoluminiscence je jev, který vzniká interakcí elektronového svazku s materiálem generujícím luminiscenci. Jeho výsledkem je produkce fotonů v infračervené, viditelné a ultrafialové oblasti elektromagnetického spektra. Metodika emise fotonů z luminiscenčních materiálů může být aplikována na polovodiče, zrna minerálů v horninách, chemické látky poskytující fluorescenci nebo specifické značky vázané na biologické vzorky a slouží k jejich hlubším analýzám. Předkládaná práce je zaměřena na využití systému chlazení vzorků v rastrovacím elektronovém mikroskopu a určení závislosti katodoluminiscenčního spektra na teplotě vzorku.
An innovative method for the preparation of fully hydrated samples of microbial biofilm Candida parapsilosis is presented in this study. Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) and high-pressure freezing (HPF) rank among cutting edge techniques in the electron microscopy of hydrated samples such as biofilms. However, the combination of these techniques is not always easily applicable. Therefore, we present a method of combining high-pressure freezing using EM PACT2 (Leica Microsystems), which fixes hydrated samples on small sapphire discs with a diameter 1.4 mm, with a high resolution SEM (Jeol) equipped with the widely used cryo-preparation system ALTO 2500 (Gatan). Using a holder developed in house, a freeze-fracturing technique was applied to image yest cultures cultivated on the sapphire discs. The main goal of our investigations was the detailed visualization of biofilm extracellular matrix and areas where the microbial cells adhere to the substrate/surface. and Předložená studie představuje nové technické řešení umožňující kombinaci mrazového lámání (freeze- -fracturing) malých safírových disků s poloměrem 1,4 mm používaných pro vysokotlaké mražení (high pressure freezing, HPF) a zobrazování pomocí kryogenní rastrovací elektronové mikroskopie (cryo-SEM). Práce zahrnuje podrobný popis metodologie a její demonstraci na plně hydratovaných vzorcích kvasinkových biofilmů, kmen Candida parapsilosis, který patří mezi významné mikroorganismy v klinické praxi. Cryo-SEM a HPF jsou považovány za špičkové techniky v elektronové mikroskopii, avšak jejich kombinace není vždy snadno použitelná. Popsané technicko-metodologické řešení umožňuje kombinaci vysokotlakého zmrazování pomocí EM PACT2 (Leica Microsystems) a zobrazování perpendikulárního mrazového lomu pomocí SEM (Jeol), který je vybaven systémem ALTO 2500 (Gatan). Pro uchycení vzorku a jeho následné lámání byl vyvinut speciální držák, jehož použití je demonstrováno na několika experimentech zabývajících se výzkumem ultrastruktury mikrobiálních biofilmů, kde je hlavním cílem vizualizace biofilmu se zaměřením na kvalitu promražení jeho extracelulární polymerní substance (EPS) a detekce oblasti přilnutí mikrobiálních buněk k substrátu/povrchu safírového disku.