Cíle studie: Cílem studie bylo vytvořit protokol pro zpracování vzorků moči pro získání aminokyselinových profilů pomocí iontově výměnné chromotografie s detekcí ve viditelném spektru (IEC/Vis) na základě tvorby komplexů aminokyselin s ninhydrinem a následné zkrácení času analýzy pro klinicky zajímavé molekuly (sarkosin či taurin), které mohou byt využity jako potenciální nádorové biomarkery. Typ studie: Metodická Materiál a metody: Vzorky moči, odebrané pacientům s diagnostikovaným karcinomem prostaty (n = 500) byly shromažďovány po dobu 1 roku a uskladňovány při teplotě -80°C. Pro vlastní analýzu aminokyselinových profilů byly vzorky připraveny kyselou hydrolýzou v mikrovlnném reaktoru. Za optimalizovaných podmínek (80 W, 120°C, 25 bar, 105 min) bylo 500 μl vzorku, smíchaného s 500 μl 35% kyseliny chlorovodíkové zhydrolyzováno na výsledný produkt, který byl následně ředěn pufrem sodíkového cyklu (0,2 mol/l NaCl, 60 mmol/l C6H807, 1,5 mmol/l N3Na a 0,4 % S(CH2CH2OH)2). Po centrifugaci (25 000 g při 4°C, 20 min) byly vzorky neutralizovány (0,6 mol/l NaOH) a analyzovány iontově-výměnnou kapalinovou chromatografií s postkolonovou derivatizací ninhydrinem využívající optickou detekci při vlnových délkách λ = 440 a 570 nm. Pro detekci sarkosinu a taurinu byly vzorky připraveny odpařením 250 μl vzorku na dusíkové odparce (40 min, teplota dusíku 60°C, tlak 1 bar) a následně resuspendovány pufrem sodíkového cyklu (250 μl). Výsledky a závěr: Analýzou aminokyselinových profilů (n = 500) bylo zjištěno, že lze docílit získání důležitých informací z neinvazivně odebraných vzorků moči. Použití dusíkové odparky redukuje manipulaci se vzorkem a zlepšuje opakovatelnost analýzy. Zkrácená analýza sarkosinu a taurinu ze vzorků odpařených na dusíkové odparce může sloužit jako metoda pro citlivou a nízkonákladovou analýzu klinických vzorků., Objective: The aim of our study was to prepare a protocol for pre-treatment of clinical urinary samples, subsequently employed for acquirement of amino acid profiles via ion exchange chromatography with detection in visible spectrum (IEC/ Vis). Further for clinically interesting biomolecules as sarcosine and taurine the optimization was carried out to shorten the analysis time. Design: Methodological Material and methods: Urine specimens from patients diagnosed with prostate cancer (n = 500) were collected within 1 year and stored in -80°C. Samples were processed for analysis of amino acid profiles through acidic hydrolysis in a microwave reactor. Using optimized conditions (80 W, 120°C, 25 bar, 105 min), 500 μL sample, mixed with 500 μL of 35% hydrochloric acid hydrolyzed. That resulted in product, which was subsequently diluted in buffer of sodium cycle (0.2 mol/L NaCl, 60 C6H807 mmol/L, 1.5 mmol/L and 0.4% N3Na S(CH2CH2OH)2). After centrifugation (25000 g at 4°C, 20 min), the samples were neutralized (0.6 mol/l NaOH) and analyzed using ion-exchange liquid chromatography with post-column derivatization with ninhydrin, using the detection wavelength λ = 440 and 570 nm (IEC/Vis). For analysis of sarcosine and taurine, the samples were prepared by evaporation of 250 μL of sample employing a nitrogen evaporator (40 min, temperature 60°C. Nitrogen pressure of 1 bar) and resuspended with buffer of sodium cycle (250 μL). Results and conclusion: The analyses of amino acid profiles offer interesting clinical information not only in non-invasively collected urinary samples, but also in other organic matrices. Employment of nitrogen evaporator for sample pre-treatment leads to reduction of manipulation with sample and its combination with shortened analyses times of sarcosine and taurine may serve as a sensitive and low-cost method for analysis of clinical specimens., Cernei N., Heger Z., Veselý Š., Zítka O., Adam V., Kizek R., and Literatura
Background and objective: Investigation of the effects of MnTnHex-2-PyP on some markers of inflammation and lipid peroxidation in an asthma mice model. Methods: The experiment was carried out on 24 female mice C57Bl/6, divided into four groups: group 1, controls; group 2, injected with ovalbumin (OVA); group 3, treated with MnTnHex-2-PyP and group 4, treated with OVA and MnTnHex-2-PyP. The animals from groups 1 and 3 were injected i.p. on days 0 and 14 with a 100 μl phosphate-buffered saline (PBS), and those from groups 2 and 4 were injected with a 100 μl ovalbumin solution, containing 20 μg OVA. On days 24, 25 and 26 the mice from groups 1 and 2 were inhaled with PBS for 30 min, and those from groups 2 and 4 were given a 1% ovalbumin solution. One hour before inhalation, and 12 hours later the animals from groups 1 and 2 were injected i.p. with 100 μl PBS, and those from groups 3 and 4 received a 100 μl MnTnHex-2-Pyp solution in PBS сontaining 0.05mg/kg. Results: Ovalbumin alone (group 2) increased the total cell number, total protein content, the levels of IL-4, IL-5 and 8-isoprostane in bronchoalveolar lavage. Elevations were observed in IgE level in serum, and the malone dialdehyde (MDA) content in the lung homogenate. These markers were decreased significantly in group 4 as compared to the OVA group. Conclusions: MnTnHex-2-Pyp reduces the inflammation and lipid peroxidation in Ovalbumin-induced mice asthma model, Veneta Shopova, Lyudmil Terziev, Violeta Dancheva, Galya Stavreva, Milena Atanasova, Angelina Stoyanova, Tzvetan Lukanov, and Literatura
Inzulinovou rezistenci (IR) definujeme jako stav, při němž normální koncentrace volného plazmatického inzulinu vyvolává sníženou odpověď organizmu. V užším slova smyslu IR chápeme jako poruchu účinku inzulinu v cílové struktuře, která může vzniknout na kterékoli úrovni inzulinové signalizační kaskády. V klinických podmínkách ji obvykle definujeme jako poruchu účinku inzulinu v metabolizmu glukózy, i když platí, že porucha se může se týkat různých účinků inzulinu a různých buněčných struktur. Charakteristickým rysem IR svázané s metabolickým syndromem či diabetem 2. typu je defektní signalizace, která postihuje PI3-kinázovou větev inzulinové signalizační kaskády. Další účinky inzulinu, které závisí na signalizaci vedoucí přes Ras komplex a MAP-kinázu, nemusí být postiženy. Vlivem kompenzatorní hyperinzulinemie mohou být dokonce zvýšeny. Článek shrnuje některé novější poznatky týkající struktury a regulací inzulinové signalizační kaskády a rozebírá vybrané primární a sekundární příčiny IR, které zahrnují faktory genetické a epigenetické, regulační roli mikroRNA a metabolické, humorální a imunologické faktory. Detailní poznání příčin IR nabízí možnosti její racionální léčby. Ta se v současné době opírá o léčbu odstranitelných příčin IR, tj. důslednou kompenzaci diabetu, redukci hmotnosti, režimová opatření (dieta, fyzická aktivita), přehodnocení potřeby léčby kortikoidy, léčbu přidružených onemocnění, a případně podání metforminu či pioglitazonu. Klíčová slova: cytokiny – inzulinová rezistence – inzulinová signalizační kaskáda, Insulin resistance (IR) is defined as a condition where normal plasma free insuconcentrations induce a reduced response of the body. In the narrower sense we understand IR as the impairment of insulin action in the target structure which may arise at any level of the insulin signalling cascade. In the clinical conditions we usually define it as the impairment of insulin action in glucose metabolism, although it is true that the impairment may concern different effects of insulin and different cell structures. The characteristic feature of IR linked to the metabolic syndrome or Type 2 diabetes is defective signalling which affects PI3-kinase branch of insulin signalling cascade. Other insulin actions depending on the signalling through the Ras complex and MAP-kinase, may not be affected. Due to compensatory hyperinsulinemia they may be even increased. The article summarizes some recent findings regarding the structure and regulation of insulin signalling cascade and analyses selected primary and secondary causes of IR which include genetic and epigenetic factors, the microRNA regulation role, metabolic, humoral and immunological factors. The detailed knowledge of the causes of IR opens possibilities of its rational treatment. This is currently based on the treatment of curable causes of IR, i.e. consistent compensation of diabetes, weight reduction, regimen arrangements (diet, physical activity), re-assessment of the need to use corticosteroids in therapy, treatment of coexisting conditions and possibly administration of metformin or pioglitazone. Key words: cytokines – insulin resistance – insulin signalling cascade, and Terezie Pelikánová
Oxidační stres je do určité míry fyziologickým důsledkem řady biochemických a bioenergetických pochodů a doprovází aerobní organizmy po celý jejich život. Podílí se na přirozeném stárnutí organizmu a významnou úlohu zastává v imunologické odpovědi. Každý organizmus má vyvinutý komplexní antioxidační systém, který ho chrání před radikálovým poškozením. Selhání tohoto vysoce specializovaného systému může vést k nevratnému poškození biomolekul a závažně tím poškodit jejich fyziologické funkce. Radikálové poškození a ztráta funkcí mozkových buněk je charakteristická pro neurodegenerativní onemocnění jako Alzheimerova choroba (ACH). To je důvod, proč se zvýšený oxidační stres považuje za iniciální impulz vzniku tohoto závažného progredientního onemocnění. Článek podává přehled patobiochemických mechanizmů oxidačního stresu v mozkové tkáni doprovázejících rozvoj Alzheimerovy choroby., Oxidative stress is to some extent a physiological consequence of biochemical and bioenergetic processes and accompanies aerobic organisms throughout their lives. Oxidative stress contributes to the natural aging and plays an important role in the immune response. Each organism has developed a complex system of antioxidant defense which protects it against the free radical damage. The failure of this highly specialized system can lead to irreversible damage to biomolecules and thereby seriously damage their physiological functions. Radical damage and loss of functions of brain cells is characteristic of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease. This is the reason why the increased oxidative stress is thought to be the initial impetus for developing this progressive disease. This article brings an overview of pathobiochemical mechanisms of oxidative stress in the brain tissue that accompany progression of Alzheimer´s disease., Chmátalová Z., Skoumalová A., and Literatura
Cíl studie: stanovení parametrů oxidačního stresu a statutu antioxidačního systému v průběhu akutní pankreatitidy Typ studie: observační, strukturálně vyvážená studie případů a kontrol Materiál a metody: Do studie bylo zařazeno 13 pacientů s akutní pankreatitidou (AP) a dále na základě věku a pohlaví spárované dvě kontrolní skupiny, a to skupina zdravých osob (KON) a osob, které prodělaly v minulých 2-3 letech akutní pankreatitidu (PAP). Pacientům s AP byly odebírány vzorky celkem 4, nejprve během prvních 24 hodin od objevení příznaků, poté po 72 hodinách, třetí odběr byl prováděn 5. den a poslední odběr 10. den onemocnění. U všech pacientů byly stanovovány kromě základních klinických a biochemických parametrů aktivity antioxidačních enzymů, koncentrace některých antioxidantů (redukovaný glutation (GSH), vitamin A a E) a parametry oxidačního stresu (konjugované dieny v precipitovaných LDL (CD/LDL) a oxidované LDL(ox-LDL)). Ke statistickému zpracování výsledků byl použit program STATISTICA (Stat Soft, CZ). Výsledky: Výsledky naší studie potvrzují zvýšený oxidační stres u pacientů s AP, a to zvýšenými hladinami CD/LDL u všech odběrů AP ve srovnání s CON (p < 0,05) a vzrůstajícími hladinami ox-LDL v průběhu AP s maximem 5. den AP. Pozorovali jsme rovněž změny v antioxidačním systému u AP pacientů; u těchto pacientů jsme zjistili snížené aktivity glutationperoxidázy a arylesterázové i laktonázové paraoxonázy během všech odběrů a dále pak snížené hladiny sérových antioxidantů – albuminu, vitaminu A a vitaminu E při porovnání s kontrolní skupinou. Závěr: Ve studii byl pozorován zvýšený oxidační stres a porušený antioxidační systém v časné fázi AP s gradací mezi třetím a pátým dnem AP., Objective: to assess oxidative stress and antioxidant status in acute pancreatitis and their natural course over the 10-day period. Design: observation, matched case-control study Material and methods: Into our study 13 patients with acute pancreatitis (AP) were included together with 13 sex- and agehealthy controls (CON) and 13 sex- and age- matched controls enrolled from persons that suffered from AP 2 – 3 years ago (PAP). We observed the antioxidant status of AP patients during the disease and the samplings were taken four times – on the first 24 hours of disease (AP1), after 72 hours from disease onset (AP3), on the 5th (AP5) and on the 10th day (AP10). In all studied groups markers of oxidative stress (level of conjugated dienes in precipitated LDL, oxidized LDL) and levels of antioxidants were assessed. We measured activities of superoxide dismutase (CuZnSOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase 1 (GPX1) and glutathione reductase (GR) in erythrocytes and arylesterase (PON1-A) and lactonase (PON1-L) activities of paraoxonase in serum and concentrations of reduced glutathione (GSH) in erythrocytes and concentrations of vitamins E and A in serum. Results: In our study we confirmed increased oxidative stress in AP, with higher levels of CD/LDL in all AP samplings compared to CON (p < 0.05) and with increasing levels of ox-LDL during the AP with the maximum on the 5th day. We have shown altered status of antioxidant system; the activities of both PON1 activities as well as activity of GPX1 were depressed in all AP samplings in comparison to CON. We have also observed decreased levels of serum antioxidants – albumin, vitamin A and vitamin E in AP Conclusion: High oxidative stress and impaired antioxidant status was observed during early phase of AP with the gradation between 3rd and 5th day of AP., Vávrová L., Kodydková J., Macášek J., Ulrych J., Žák A., and Literatura 24
Diabetická retinopatie (DR) je typickou mikrovaskulární komplikací diabetu 1. i 2. typu. Ve vyspělých zemích je nejčastější příčinou slepoty u osob v produktivním věku. Základní metabolickou odchylkou, která hraje nejdůležitější roli při jejím vzniku, je hyperglykemie. Hyperglykemie zvyšuje mitochondriální produkci reaktivních kyslíkových radikálů a oxidační stres, vede k hromadění pokročilých produktů glykace (AGE), tvorbě hexosaminu, akcentaci polyolové cesty a zvýšení osmoticky aktivního sorbitolu, a ke zvýšení proteinkinazy C (PKC). Závažnost vaskulární patologie je významně ovlivněna genetickou dispozicí jedince a je modifikována dalšími metabolickými a hemodynamickými faktory. Tyto podněty aktivují intracelulární signální molekuly, jako je protein kinázy B (Akt kináza), mitogeny aktivovaná protein kináza (MAPK), cyklin-dependentní kinázy či nukleární faktor-?B (NF-?B). Uvedené abnormity ovlivní nejprve funkci a později i morfologii celé řady cílových buněk, které zahrnují nejen buňky orgánu vlastní (endotelové buňky, pericyty, neurony, glie, pigmentový epitel), ale také imunokompetentní buňky, které infiltrují do místa patologie z cévního řečiště (nonrezidentní buňky). Aktivované buňky pak vedou k produkci řady mediátorů s vazoaktivními a růstovými vlastnostmi. Výsledkem je komplex, zpočátku funkčních a později strukturálních změn, které se projeví v dysregulaci a) krevního průtoku, b) buněčného růstu (apoptóza, proliferace, hypertrofie) a vedou k c) proliferaci vaziva, zmnožení extracelulární hmoty ztluštění bazálních membrán. Důsledkem je pak rozvoj morfologicky fixované orgánové patologie. Poznání patofyziologických mechanizmů rozvoje DR dává naději na možnou kauzální léčbu a prevenci., Terezie Pelikánová, and Lit. 43
Alzheimerova choroba (ACH) se řadí mezi závažná neurodegenerativní onemocnění provázená oxidačním stresem. Produkty radikálových reakcí mohou difundovat z primárních míst a být detekovány v cerebrospinální tekutině (CSF) či krvi. Tyto produkty představují potenciální biochemické markery pro diagnostiku ACH. Nejvíce pozornosti je zaměřeno na analýzu CSF, protože odráží patologické změny v mozkové tkáni u ACH. V CSF byly potvrzeny zvýšené hladiny oxidačních produktů lipidů i proteinů. Hladiny vitaminů jsou snížené, nicméně existují i práce, které nenašly rozdíly oproti kontrolám. Některé studie se zaměřily na detekci produktů oxidačního stresu v krvi u ACH, ale výsledky nejsou konzistentní. Část prací ukazuje na nárůst oxidačních produktů a snížené hladiny antioxidantů v plazmě. Nicméně jiné práce tyto výsledky nepotvrdily. Z hlediska hledání diagnostického biomarkeru pro ACH má význam se zaměřit na specifické produkty peroxidace lipidů, tzv. lipofuscinoidní pigmenty (LFP), v erytrocytech. Na základě fluorescenčních analýz LFP je možné najít specifický produkt v krvi u ACH., Alzheimer´s disease (AD) is a serious neurodegenerative disorder accompanied by oxidative stress. Products of free radical reactions diffuse from primary sites and can be detected in cerebrospinal fluid (CSF) and blood. Such products represent potential biochemical markers for diagnosis of AD. Most studies are focused on CSF since its composition reflects pathological changes in the brain in AD. Increased levels of lipid and protein oxidative products have been found in CSF. Levels of vitamins were reduced in CSF. However, there are studies which show no difference between AD and controls. There is research on free radical products in blood in AD but results are not consistent. Several studies show increased oxidative products and reduced antioxidant in plasma. Nevertheless, others did not confirm it. Considering the investigation of a diagnostic biomarker for AD, specific end-products of lipid peroxidation, so called lipofuscin-like pigments (LFP), in erythrocytes represent an important possibility. A specific product in blood in AD can be found by means of fluorescence analyses of LFP., Skoumalová A., and Literatura 35