Úvod: Fúzní transkript BCR-ABL, prokazatelný v periferní krvi nebo vzorku kostní dřeně, je specifickým molekulárním markerem chronické myeloidní leukémie a akutní lymfoblastické leukémie s nálezem Filadelfského chromozomu. Moderní kvantitativní molekulárně biologická vyšetření jsou založená na technologii real-time PCR a fluorescenčních sondách komplementárních vůči vyšetřovanému DNA/cDNA templátu. Současný trend v laboratorní medicíně a aplikované molekulární biologii podporuje snahu o externí hodnocení kvality a přenositelnost výsledků kvantitativních PCR analýz. Cílem studie je porovnat diagnostický význam dvou analytických systémů určených pro kvantifikaci BCR-ABL s ohledem na současná doporučení programu Europe Against Cancer Program (EAC). Materiál a metody: Celkem bylo analyzováno 148 vzorků (143 vzorky periferní krve a 5 aspirátů kostní dřeně) získaných od 80 dospělých jedinců. Vzorky byly vyšetřeny paralelně dvěma kvantitativními postupy s normalizací na příslušný house-keeping gen. První postup byl založen na reverzní transkripci RNA pomocí enzymu Superscript III (Invitrogen) a kvantifikaci BCR-ABL soupravou M-bcr FusionQuant Kit (Ipsogen). Druhý postup používal soupravu LightCycler t(9;22) Quantifi cation Kit (Roche). Výsledky: Kalibrační rovnice pro BCR-ABL gen (FusionQuant) byla: CT = -3,54 . log(conc BCR-ABL) + 42,33; automatický threshold = 0,06, korelační koeficient r = -1,00, reakční účinnost = 92 %. Souprava firmy Roche nepoužívá pro kvantifikaci BCR-ABL genu kalibrační proces. Kalibrační rovnice pro ABL gen (FusionQuant) byla CT = -3,53 . log(conc ABL) + 40,91, threshold pro ABL = 0,08, r = -1,00, reakční účinnost = 91 %. Kalibrační rovnice pro G6PDH gen (Roche) byla CT = -3,2 . log(conc G6PDH) + 30,9, r = -1,00, reakční účinnost = 100 %. Minimální koncentrace BCR-ABL stanovitelná soupravou FusionQuant byla 10 kopií v 5 µl použité cDNA. Nejnižší relativní koncentrace BCR-ABL stanovitelná soupravou Roche byla 0,001 %. Experimentální data ukázala lineární závislost mezi hodnotami relativní koncentrace BCR-ABL dosaženými oběma metodami s korelačním koeficientem r = 0,77, p < 0,001. Závěr: Mezi principiální rozdíly obou testovaných souprav patří výběr house-keeping genu použitého pro normalizaci koncentrace BCR-ABL. V souladu s doporučeními programu Europe Against Cancer jsme pro rutinní vyšetření v naší laboratoři zvolili soupravu FusionQuant s normalizací na ABL gen. Klíčová slova: BCR-ABL, kvantifikace, real-time PCR, house-keeping gen, ABL gen, EQA., Objective: A BCR-ABL fusion transcript found in peripheral blood or bone marrow is a specific molecular marker of chronic myeloid leukemia and Philadelphia chromosome – positive acute lymphoblastic leukemia. Modern quantitative analyses in molecular biology are based on real-time PCR technology and fluorescent probes targeted to a complementary part of DNA/cDNA templates. A current trend in laboratory medicine and applied molecular biology is to support proficiency testing and transferability of results of quantitative PCR analyses. The goal of the study is to compare the diagnostic impact of two used systems for BCR-ABL quantification with respect to recommendations of the Europe Against Cancer Program (EAC) unifying the used BCR-ABL methodology. Material and Methods: A total of 143 peripheral blood specimens and 5 bone marrow aspirates from 80 adult subjects were analysed. Two quantitative procedures were simultaneously examined. Procedure I was based on Superscript III reverse transcription (Invitrogen) and M-bcr FusionQuant Kit (Ipsogen) for relative quantification of BCR-ABL. In procedure II we used LightCycler t(9;22) Quantification Kit (Roche). Results: The calibration curve for BCR-ABL gene (FusionQuant) was: CT = -3.54 . log(conc BCR-ABL) + 42.33; automatic threshold = 0.06, correlation coefficient (r) = -1.00, reaction efficiency = 92%. The Roche kit does not use any calibration process for BCR-ABL. The calibration curve for ABL gene (FusionQuant) was CT = -3.53 . log(conc ABL) + 40.91, ABL threshold = 0.08, r = -1.00, reaction efficiency = 91%. The calibration curve for G6PDH control gene (Roche) was CT = -3.2 . log(conc G6PDH) + 30.9, r = -1.00, reaction efficiency = 100%. The limit of quantification for BCR-ABL (FusionQuant) was 10 copies in 5 µl of the used cDNA. The lowest relative concentration of BCR-ABL detectable by the Roche assay was 0.001 %. The experimental data showed a close linear association in relative quantity of BCR-ABL received by the examined assays with r = 0.77, P < 0.001. Conclusions: The principal difference between the tested procedures is the house-keeping gene used for normalization of BCR-ABL quantity. In agreement with the Europe Against Cancer strategy we have selected ABL gene as a normalization gene for our lab., Beránek M., Hegerová J., Voglová J., Bělohlávková P., and Lit.: 17
Úvod: Léčba chronické myeloidní leukemie (CML) tyrozinkinázovými inhibitory (TKI) výrazně ovlivnila přežití nemocných všech věkových kategorií. V naší práci retrospektivně analyzujeme dosaženou léčebnou odpověď a toxicitu léčby imatinibem podle věku pacientů (≤ 60 let vs > 60 let). Tito nemocní na našem pracovišti zahájili léčbu imatinibem v letech 2001–2013 a léčba trvala minimálně 18 měsíců. Pacienti a metodika: Celý soubor představuje 103 pacientů (52 žen, 51 mužů) s mediánem věku v době diagnózy CML 55 let (rozpětí 19–88 let). Skupina mladších pacientů zahrnuje 68 pacientů (31 žen, 37 mužů) s mediánem v době diagnózy 43 let (rozpětí 19–59 let) a skupinu starších pacientů tvoří 35 pacientů (21 žen, 14 mužů) s mediánem věku v době diagnózy 70 let (rozpětí 61–86 let). Medián dávky imatinibu byl v obou skupinách shodný 400 mg denně (rozpětí 200–600 mg). Výsledky: V průběhu léčby jsme pozorovali ve skupině starších pacientů vyšší četnost výskytu hematologické toxicity (p = 0,0059). Po 12 měsících léčby bylo dosaženo kompletní cytogenetické odpovědi (CCyR) u 90 % mladších pacientů a u 74 % starších pacientů, velké molekulární odpovědi (MMR) po 18 měsících léčby bylo dosaženo u 79 % mladších pacientů a 63 % starších pacientů. Závěr: Tyto výsledky představují v obou skupinách velmi dobrou léčebnou odpověď bez vlivu věku v době diagnózy na dosažení této odpovědi., Introduction: Treatment of chronic myeloid leukemia (CML) with tyrosine kinase inhibitors (TKI) has significantly changed the survival of patients of all age categories. In our work, we have tried retrospectively to analyze a therapeutic response and toxicity of imatinib according to age of patients (≤ 60 years vs > 60 years). Patients have started treatment with imatinib in 2001–2013 in our department. The duration of treatment was at least 18 months. Patients and methods: The whole group contains 103 patients (52 women, 51 men) with a median age at diagnosis of CML 55 years (range 19–88 years). The first group includes 68 the younger patients (31 women, 37 men) with a median age at diagnosis 43 years (range 19–59 years) and the second group 35 the elderly patients (21 women, 14 men) with a median age at diagnosis 70 years (range 61–86 years). Median imatinib dose in both groups was the same – 400 mg per day (range 200–600 mg). Results: In the elderly patients we observed higher rates of hematological toxicities (p = 0.0059). After 12 months treatment, a complete cytogenetic response (CCyR) was achieved in 90 % of younger patients and in 74 % of the elderly patients, respectively. Major molecular response (MMR) at 18 months treatment was achieved in 79 % of the younger group and in 63 % of the elderly group. Conclusion: The results represent in both groups very good therapeutic response independent of age of patients at the time of CML diagnosis., and Petra Bělohlávková, Jaroslava Voglová, Jakub Radocha, Pavel Žák
Chronická myelomonocytová leukémia (CMML) je ochorením krvotvornej kmeňovej bunky, ktoré nesie zároveň črty myelodysplázie i myeloproliferácie. Vyskytuje sa relatívne zriedkavo, najmä u starších osôb, a môže prechádzať do akútnej myeloblastovej leukémie. V poslednom období sa pomocou sofistikovaných molekulovo-biologických technológií podarilo určiť, že veľká časť pacientov nesie mutácie v epigenetických regulačných génoch (napr. TET2, ASXL1, …), ktoré modifikujú kondenzáciu chromatínu a v konečnom dôsledku i génovú expresiu. Tieto skutočnosti umožnili zaradenie hypometylačných látok (HMA) do štandardnej liečby CMML a otvárajú bránu pre využitie ďalších molekúl. Cieľom príspevku je ukázať na konkrétnych príkladoch súčasné možnosti diagnostiky a terapie CMML a tiež zmieniť niektoré úskalia spojené s využitím nových postupov., Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a hematopoietic stem cells disorder, it carries myelodysplastic and myeloproliferative features. CMML occurs rarely, especially in the elderly, and often transforms into acute myelogenous leukemia. Recently, in a large proportion of patients sophisticated molecular-biology technologies can determine mutations in epigenetic regulatory genes (e.g. TET2, ASXL1, …) that modify chromatin condensation and also gene expression. These facts support the inclusion of hypomethylating agents (HMA) in the standard treatment of CMML and opened the gates for the use of other new molecules. The aim of this paper is to describe concrete examples of current diagnostics and treatment of CMML and demonstrate the complexity of the new approaches., Peter Rohoň, Petra Bělohlávková, Zuzana Rusiňáková, Vít Procházka, Eva Kadlčková, Luděk Raida, Alžběta Zavřelová, Marie Jarošová, Pavel Žák, Karel Indrák, and Literatura
Myelodysplastický syndrom (MDS) je jedno z nejčastějších hematologických onemocnění ve věku nad 60 let. Přes intenzivní výzkum je však terapie této heterogenní krevní choroby velmi komplikovaná. V posledních letech se objevily 2 nové terapeutické přístupy, a to imunomodulační léčba a demetylační terapie. Zvláště imunomodulační léčba, reprezentovaná preparátem lenalidomid, znamená velký pokrok v léčně anemických nemocných specificky s 5q- aberací. Odpověď, především dosažení transfuzní nezávislosti, se pohybuje v původních studiích kolem 60–80 %. U nás byla tato terapie zahájena v roce 2008. Prezentujeme analýzu 34 nemocných, 31 žen, 3 mužů s mediánem věku 69 (46–80 let), z toho 27 nemocných (79,4 %) mělo diagnózu 5q- syndromu, 5 nemocných diagnózu refrakterní anémie s multilineární dysplazií, 1 nemocný refrakterní anémii s excesem blastů (RAEB 1) a 1 pacient neklasifikovatelný myelodysplastický syndrom/myeloproliferativní syndrom. Data nemocných jsou ukládána do lenalidomidové lišty Českého MDS registru. Jde o nemocné chronicky transfundované s diagnózou MDS s nižším rizikem a 5q- aberací. V našem souboru jsme zaznamenali odpověď na terapii reprezentovanou dosažením kompletní transfuzní nezávislosti u 91 % nemocných. Kompletní cytogenetická odpověď byla dosažena u 15 % nemocných a parciální odpověď u 67 %. U 15 % nemocných byla zjištěna mutace tumor supresorického genu TP53 (3 z 18 vyšetřených nemocných, 2 z nich progredovali do MDS s vyšším rizikem a následně do AML). Lenalidomid byl u většiny nemocných velmi dobře tolerován. Na tomto, byť zatím malém souboru prezentujeme vysokou efektivitu tohoto preparátu a základní principy a problematiku terapie lenalidomidem., Myelodysplastic syndrome (MDS) is a common hematological disease in patients over sixty. Despite intensive research, the therapy of this heterogeneous blood disease is complicated. In recent years, two new therapeutic approaches have been proposed: immunomodulation and demethylation therapy. Immunomodulation therapy with lenalidomide represents a meaningful advance in the treatment of anemic patients, specifically those with 5q- aberrations. As much as 60–70 % of patients respond and achieve transfusion independence. We present the initial lenalidomide experience of the Czech MDS group. We analyze Czech MDS register data of 34 (31 female; 3 male; median age 69 years) chronically transfused low risk MDS patients with 5q- aberration treated by lenalidomide. Twenty-seven (79.4 %) patients were diagnosed with 5q- syndrome, 5 patients with refractory anemia with multilineage dysplasia, 1 patient with refractory anemia with excess of blasts 1, and 1 patient with myelodysplastic/myeloproliferative unclassified. Response, as represented by achieving complete transfusion independence, was achieved in 91 % of patients. A true 5q- syndrome diagnosis in most our patients may be responsible for such a high response rate. Complete cytogenetic response was reached in 15 % of patients and partial cytogenetic response in 67 %, within a median time of 12 months. TP53 mutation was detected in 15 % (3 from 18 tested) and 2 of these patients progressed to higher grade MDS. The majority of patients tolerated lenalidomide very well. Based on this albeit small study, we present our findings of high lenalidomide efficacy as well as the basic principles and problems of lenalidomide therapy., and Anna Jonášová, Libor Červinek, Petra Bělohlávková, Jaroslav Čermák, Monika Beličková, Petr Rohoň, Olga Černá, Ivana Hochová, Magda Šišková, Karla Kačmářová, Eva Janoušová